Das zertifizierte Referenzmaterial BAM-F012 der Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung ist ein glasbasierter Multi-Emitter-Fluoreszenzstandard. Wird der Standard mit UV-Licht angeregt, zeigt er ein charakteristisches Muster schmaler Emissionsbanden im sichtbaren Spektralbereich.

In diesem Applikationsbeispiel untersuchen wir dieses Muster mit unserem DIY-Spektrometer, überprüfen die Plausibilität der Wellenlängenkalibrierung und erläutern den Unterschied zwischen einem Rohspektrum und einer spektral korrigierten Intensitätsmessung.

Fluoreszenzspektren sind schnell aufgenommen - aber ihre richtige Interpretation ist anspruchsvoller, als es auf den ersten Blick scheint. Das Spektrum einer fluoreszierenden Probe hängt nicht nur von der Probe selbst ab, sondern auch von Anregungsquelle, Messgeometrie, optischen Filtern, Gitter, Lichtleiter, Detektor und der spektralen Empfindlichkeit des gesamten Messsystems.

Hintergrund: Warum Fluoreszenzstandards wichtig sind

Bei einer Fluoreszenzmessung wird eine Probe mit Licht einer kürzeren Wellenlänge angeregt. Nach der Anregung emittiert die Probe Licht überwiegend längerer Wellenlängen. Die charakteristischen Bandenpositionen von BAM-F012 bieten Orientierungspunkte zur Überprüfung der Wellenlängenkalibrierung. Die Intensitäten hängen dagegen zusätzlich stark vom Messsystem ab.

Das ist der Grund, warum Fluoreszenzspektrometer regelmäßig überprüft werden sollten. Alternde Lampen, verschmutzte Optiken, geänderte Gitterstellungen, unterschiedliche Detektorempfindlichkeiten oder geänderte Filter können das gemessene Spektrum verschieben oder in seiner Form verändern. Ein Referenzmaterial mit stabilem, gut definiertem Emissionsmuster ist deshalb ein praktischer Maßstab für den Alltag im Labor.

Was ist BAM-F012?

BAM-F012 ist ein zertifiziertes Referenzmaterial für die Fluoreszenzspektroskopie der Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung (BAM). Seine Entwicklung baut auf gemeinsamen Forschungsarbeiten der BAM, der SCHOTT AG und der Universität Paderborn zu glasbasierten Fluoreszenzstandards auf, die unter anderem im Rahmen des BMBF-geförderten Projekts FLUOPLEX durchgeführt wurden. Das daraus hervorgegangene Multi-Emitter-Glas wurde von der BAM umfassend charakterisiert und 2014 als Referenzmaterial BAM-F012 zertifiziert.

Es besteht aus einem fluoreszierenden Multi-Emitter-Glas, das u. a. in typischen Küvettenabmessungen von etwa 12,5 mm × 12,5 mm × 40 mm geliefert werden kann. Das Glas basiert auf einer Lanthanphosphat-Matrix und ist mit den Seltenerd-Ionen Cer(III), Terbium(III) und Europium(III) dotiert. Bei UV-Anregung entsteht ein charakteristisches Emissionsmuster mit mehreren relativ schmalen Banden im sichtbaren Spektralbereich.

Der eigentliche Clou: Bei BAM-F012 ist nicht nur das Vorhandensein dieser Emissionsbanden beschrieben. Zertifiziert ist ein normiertes relatives Intensitätsmuster aus acht charakteristischen Banden bzw. Schultern. Die zertifizierten Werte wurden aus spektral korrigierten Messungen bei definierter 365-nm-Anregung und festgelegten Messbedingungen abgeleitet. Damit ist BAM-F012 kein beliebiges fluoreszierendes Glas, sondern ein Werkzeug zur regelmäßigen Geräteprüfung und Qualitätssicherung.

Die zertifizierten BAM-F012-Werte beziehen sich auf definierte Bedingungen: Anregung bei 365,0 nm ± 0,5 nm mit kontinuierlicher Quelle, definierte Bandbreiten, 0°/90°-Messgeometrie, kontrollierte Polarisationseinstellungen und eine Temperatur von 25 ± 2 °C. Außerdem ist eine Korrektur der spektralen Empfindlichkeit des Emissionskanals erforderlich.

Messung mit unserem DIY-Spektrometer

Für unsere Messung wurde ganz bewusst kein aufwendiger Fluoreszenz-Messplatz aufgebaut. Ziel war nur ein schneller Praxistest: Wie sieht das BAM-F012-Spektrum mit unserem DIY-Spektrometer aus und welche didaktischen Erkenntnisse kann man trotz des einfachen Aufbaus bereits ziehen?

Die Messung erfolgte mit einem DIY-Spektrometer in Czerny-Turner-Anordnung mit 150 mm Brennweite und einem 300-lp/mm-Gitter. Die Wellenlängenkalibrierung wurde pragmatisch mit drei Laserdioden bei 405 nm, 520 nm und 650 nm durchgeführt. Zur Anregung dienten dann einfache UV-LEDs unterschiedlicher Zentralwellenlänge ohne Kollimation. Das Fluoreszenzlicht wurde über eine Kante des BAM-F012-Slides in einen Lichtleiter eingekoppelt. Gezeigt wird das dunkelfeldkorrigierte Rohsignal des Sensors ohne spektrale Empfindlichkeitskorrektur.

Für die erste Aufnahme wurde BAM-F012 mit einer UV-LED der nominellen Wellenlänge 365 nm angeregt. Damit liegt die Anregung nominell nahe an der für die Zertifizierung verwendeten Wellenlänge von 365,0 nm ± 0,5 nm. Die LED ersetzt jedoch nicht die dort eingesetzte spektral definierte Anregung mit einem Bandpass von 4 nm: Ihr tatsächliches Emissionsmaximum und ihre spektrale Bandbreite wurden für diese Messung nicht bestimmt. Zudem erfolgte die Aufnahme frei Hand ohne festgelegte Messgeometrie und ohne spektrale Empfindlichkeitskorrektur. Das gezeigte Spektrum veranschaulicht daher das charakteristische Emissionsmuster von BAM-F012; seine relativen Bandenintensitäten dürfen nicht mit den zertifizierten Werten gleichgesetzt werden.

Erkennbare Banden im Rohspektrum

Die BAM-Unterlagen nennen acht charakteristische Emissionsbanden bzw. Schultern. In der ersten Aufnahme sind die meisten davon bereits direkt nachvollziehbar. Die Intensitätsverhältnisse sind dabei als Rohsignal des gesamten Messsystems zu verstehen.

Trotz dieses einfachen Aufbaus sind die charakteristischen Emissionsbanden von BAM-F012 deutlich sichtbar. Besonders markant erscheinen die grünen und roten Banden um etwa 542 nm, 591 nm, 612 nm, 620 nm und 701 nm. Damit lässt sich das typische Muster des Referenzmaterials bereits in einer sehr einfachen Messkonfiguration eindrucksvoll nachvollziehen.

Was die Messung zeigt

Das Peakmuster ist robust und sofort wiedererkennbar

Schon mit einer einfachen LED und ohne kollimierten Strahl zeigt der Slide mehrere markante Emissionsbanden. Damit eignet sich BAM-F012 auch sehr gut als anschauliches Demonstrationsobjekt für Fluoreszenzspektroskopie und als praktischer Tagescheck für den Messaufbau bei reproduzierbarer Geometrie und konstanten Messbedingungen.

Die Wellenlängenskala lässt sich gut plausibilisieren

Die charakteristischen Banden bei etwa 542 nm, 591 nm, 612 nm und 701 nm liegen in der Aufnahme an den erwarteten Stellen. Für ein DIY-Spektrometer, das nur mit drei Laserdioden kalibriert wurde, ist das ein erfreulich überzeugender erster Check.

Die Intensitäten sind noch nicht die zertifizierten Intensitäten

Das gezeigte Spektrum ist ein Rohspektrum. Es enthält nicht nur die Emission des BAM-F012-Glases, sondern auch die wellenlängenabhängige Empfindlichkeit von Gitter, Optik, Lichtleiter und Sensor. Zusätzlich beeinflussen Anregungswellenlänge, LED-Spektrum, Probengeometrie und Einkopplung die relativen Peakintensitäten.

Genau dieser Unterschied ist didaktisch wertvoll

Viele Einsteiger erwarten, dass ein gemessenes Spektrum automatisch das objektive Spektrum der Probe ist. BAM-F012 zeigt sehr elegant, dass Spektroskopie immer auch Messsystemkunde ist: Peakpositionen, Peakintensitäten, Linearität und spektrale Korrektur sind unterschiedliche Ebenen derselben Messung.

Einfluss der Anregungswellenlänge auf das Emissionsmuster

Zusätzlich zu dem bereits gezeigten Spektrum mit einer 365-nm-LED nahmen wir noch weitere Spektren mit anderen Wellenlängen auf (254, 385 und 395 nm). Die Aufnahmen zeigen deutliche Unterschiede in den relativen Stärken der Emissionsbanden. Besonders auffällig ist die grüne Bandengruppe um 542/548 nm: Bei 254-nm-Anregung ist sie im Verhältnis zur dominanten roten Bande um 612 nm kräftig ausgeprägt. Bei 365 nm bleibt sie deutlich sichtbar, tritt jedoch relativ zur roten Hauptbande zurück. Bei 385 nm und 395 nm ist die grüne Bandengruppe im gewählten Darstellungsmaßstab kaum noch erkennbar; hier dominieren die roten Emissionsstrukturen. Auch die Bande um 488 nm tritt bei 254-nm-Anregung deutlicher hervor.

Die Beobachtungen veranschaulichen, dass die Wahl der Anregungsquelle das gemessene Emissionsmuster beeinflussen kann. Die verschiedenen lumineszierenden Zentren des Multi-Emitter-Glases werden je nach Anregungswellenlänge unterschiedlich stark angeregt. Dabei ist eine LED keine monochromatische Quelle: Neben ihrer nominellen Wellenlänge beeinflussen auch die spektrale Bandbreite und die tatsächliche Lage ihres Emissionsmaximums die Anregung.