Fluoreszenz von Rhodamin

Rhodamin ist ein fluoreszierender Farbstoff, der in vielen Anwendungen, wie z. B. in der Biochemie, der Laserphysik und der Mikroskopie weit verbreitet ist. In dieser Applikationsbeschreibung wird gezeigt, wie Rhodamin in Pulverform für die Fluoreszenzmessung mit unseren DIY-Spektrometern vorbereitet und vermessen werden kann. Ziel ist es, ein Fluoreszenzspektrum aufzunehmen und die Eigenschaften von Rhodamin zu charakterisieren.

Die Fluoreszenzmessung

Vorbereitung

Für einfache Fluoreszenzexperimente reicht eine technische Qualität von Rhodamin völlig aus (oft > 90 % Reinheit). Dieses kann reativ einfach und preiswert bei den gängigen Laborausstattern bezogen werden. Die Verwendung von teurerem Rhodamin in analytischer Qualität (≥ 98 – 99 %) ist nicht nötig.

Wir verwenden für unsere Messung Rhodamin B, von dem zur Vorbereitung der Messung zunächst eine kleine Menge in ein sauberes Glasgefäß gegeben wird. Anschließend wird Ethanol als Lösungsmittel hinzugefügt und die Mischung vorsichtig umgerührt, bis sich das Rhodamin vollständig gelöst hat. Rhodamin ist gut löslich in Ethanol, sodass eine klare, intensiv gefärbte Lösung entsteht. Im letzten Schritt wird die Lösung in eine Quarzküvette gefüllt, um eine gleichmäßige und reproduzierbare Messung zu gewährleisten.

Achtung: Einige Rhodamine (insbesondere Rhodamin B) stehen im Verdacht, mutagen oder kanzerogen zu wirken. In der EU und den USA ist Rhodamin B daher nicht für den Lebensmittelbereich zugelassen. Bei der Verwendung im Labor wird die Verwendung von Handschuhen und Schutzbrille bei der Arbeit mit Rhodamin empfohlen!

Durchführung

Rhodamin lässt sich hervorragend mit einer grünen oder blauen LED (z. B. 470 – 520 nm) anregen. Die Emission ist intensiv genug, um selbst bei sehr niedriger Konzentration nachgewiesen zu werden – ideal zur Demonstration von Fluoreszenz-Sensitivität. Für eine quantitative Auswertung kann ein Vergleich mit bekannten Konzentrationen erstellt werden.

In unserem Experiment kommt jedoch ein Laserdiodenmodul mit 520 nm zum Einsatz, da hiermit die Fluoreszenz besonders schön in Szene gesetzt werden kann (siehe Bild am Anfang dieser Seite). Dort wo der aufgeweitete Laserstrahl auf die Küvette mit der ansonsten rötlich erscheinenden Flüssigkeit trifft, erkennt man deutlich die gelbliche Fluoreszenz.

Zur Messung des Fluoreszenzspektrums wird der Laserstrahl in einem Winkel von 45 Grad auf die Küvette gerichtet, so dass dann ebenfalls in einem Winkel von 45 Grad das durch die Fluoreszenz emittierte Licht durch den Lichtleiter aufgenommen und dem Spektrometer zugeführt werden kann.

Das Spektrum wurde mit einem unserer DIY-Spektrometer aufgenommen.

• Anordnung: Czerny-Turner
• Brenweite: 150 mm
• Spaltgröße: 10 µm
• Gitter: 600 lp/mm
• Detektor: Zeilenkamera e9u-LSMD-1304-STD mit 3648 Pixel
• Auflösung: 0,08 nm/Pixel
• Lichtleiter: Toslink

Ergebnis

Das aufgenommene Spektrum sollte eine klare Fluoreszenz-Emission im gelblich-rötlichen Bereich zeigen, was auf die charakteristische Emission von Rhodamin hinweist. Die Intensität des Fluoreszenzsignals hängt von der Konzentration der Lösung und den Einstellungen des Spektrometers ab.

Im grünen Bereich um die 520 nm dominiert das Licht der anregenden Laserdiode. Durch die relativ hohe Integrationszeit für die Aufnahme des Fluoreszenzsignals gerät der CCD-Sensor der im Spektrometer verwendeten Zeilenkamera hier in die Sättigung. Die so zu beobachtende spektralen Verbreiterung der eigentlich sehr schmalen Laserlinie ist daher ein Artefakt und nicht real. Für eine eventuell gewünschte Unterdrückung des anregenden Lichtes im Spektrum könnte man zusätzlich einen optischen Kantenfilter nutzen, der z. B. nur Licht ab 540 nm durchlässt.

Wissenswertes zu Rhodamin

Rhodamine sind sehr interessante fluoreszierende Farbstoffe mit breitem Einsatzspektrum – vor allem in der Forschung sind sie ein echter Klassiker. Diese Farbstoffe gehören zur Familie der Xanthenfarbstoffe. Die bekanntesten Vertreter sind Rhodamin B, Rhodamin 6G und Rhodamin 123. Sie zeichnen sich durch hohe Fluoreszenzquantenausbeuten und gute photophysikalische Stabilität aus.

• Absorptionsmaximum: meist im Bereich von 500 – 550 nm
• Emissionsmaximum: im Bereich von 560 – 610 nm
• Fluoreszenzfarbe: leuchtend pink bis orange-rot
• Löslichkeit: gut löslich in Wasser, Ethanol oder Methanol (je nach Typ)
• Stabilität: photochemisch stabil, aber teilweise empfindlich gegenüber pH-Wert und Temperatur

Einsatzgebiete

In der Forschung

Tracer in der Umweltanalytik

Rhodamin B und 6G werden als Farbtracer in Fließgewässern, Brunnen und Grundwassermodellen verwendet. Ihr Vorteil besteht darin, dass diese Substanzen schon in kleinsten Konzentrationen durch Fluoreszenzmessung extrem gut nachweisbar sind. Anwendung finden sich u. a. in der Leckageortung sowie der Strömungs- und Verweilzeitmessung.

Fluoreszenzmarker in der Biochemie

Rhodamin 123 wird bevorzugt zur Markierung von Mitochondrien verwendet. Rhodamin-Derivate werden hingegen für die Kopplung an Proteine oder Antikörper genutzt (z. B. in der Fluoreszenzmikroskopie oder in der Durchflusszytometrie). Gute Zellpermeabilität und hohe Fluoreszenz ermöglichen hier empfindliche In-vivo-Studien.

Laserfarbstoff

Rhodamin 6G ist aufgrund seiner hohen Effizienz ein beliebter Lasermedium-Farbstoff für Dioden- oder Festkörper-gepumpte Farbstofflaser.

In der Industrie

Textil- und Papierfärbung

Vor allem Rhodamin B wird zum Färben von Textilien, Seifen oder Papier eingesetzt. Wegen möglicher Toxizität wird in Kosmetik oder Lebensmitteln jedoch hierauf verzichtet.

Farbstoff für Fluoreszenz-Tinte und -Lacke

Es gibt eine Vielzahl von Verwendungen in Sicherheitsmarkierungen, UV-Tinten oder neonfarbenen Kunststoffen. In Kombination mit Schwarzlicht ergibt sich ein starker Leuchteffekt.

Kosmetika und Kunst

Auch in Kunstfarben, Neon-Lacken und Make-Up-Produkten werden ebenfalls Rhodamine verwendet.